隨著寡核苷酸黃金時代的來臨，為寡核苷酸合成造就越來越豐富的應用場景。合成是為了獲得盡可能多的、完美匹配下游應用的終產量，同時需要保證產物的質量，還要考慮如何能夠有效維系合成過程的高偶聯效率，以及成本的節約等等。那么，什么是合成終產量？合成終產量的影響因素有哪些？各個因素又是如何影響著合成終產量的？怎樣改進各因素對合成終產量的不利影響？成本的節約只是單純地對標極短的合成時間嗎？本期文章將通過以下三個方面來為您一一解答。

1. 合成終產量的理論值計算方法

2. 影響合成終產量的因素

3. 提升合成終產量的方法

一、合成終產量的理論值計算方法 

寡核苷酸合成終產量的理論值可根據以下公式計算：

例如，合成平均偶聯效率為99%的30 mer寡核苷酸（29個偶聯步驟），理論上可得75%產量（0.9929）。然而，若以98%的效率進行相同的合成，最大合成終產量僅為56%。而在實踐中，即使偶聯效率為99%，所能期望的最高合成終產量也僅為50%。在偶聯效率為98%時，合成終產量甚至低達25%。

二、影響合成終產量的因素

1. 偶聯效率（coupling efficiency）

合成的偶聯效率對終產量非常重要，決定了寡核苷酸可以合成長度以及最終產品的質量。偶聯效率下降僅幾個百分點就會大大降低實際產量，而且會影響下游純化。

在每個合成周期中（each cycle of synthesis），化學或物理因素的限制使得偶聯效率無法達到100%，因為即便使用精細的化學合成試劑，總會有一些 support-bound 寡核苷酸不會偶聯。由此，每個合成周期都會產生小于百分比 n-1 產物（<1%），并會逐步積累。隨著序列長度的增加，n-1 產物的總百分比也會增加。99.4%偶聯效率的20 mer寡核苷酸預估產量為89.2% FLP（full-length product），而具有相同偶聯效率的50 mer寡核苷酸預估產量為74.5% FLP。寡核苷酸長度、偶聯效率和FLP百分比之間的關系參看下圖。

如圖所示，合成的偶聯效率決定著合成產量及合成長度。

平均偶聯效率（average coupling efficiency）所對應的終產量可參看下表數據。

2. 合成儀

合成儀的良好性能有助于高效的合成實驗，雖然事實上，維持每臺合成儀每天的合成效率達到99%或更高是很難的，但是優質的合成儀可以作為提升并保持高效合成效率的前提和保障。那么，合成儀值得關注的性能參數主要指那些？

（1）在合成較長鏈且可獲得一定的產物得率的背景下，合成效率可達99%以上。

單一合成效率的數據缺乏嚴謹性與可信度，具備合成長度及規模的前提是必要的，這樣的合成效率數據才能使用戶了解到更加真實準確的合成效率，為實際應用做好準備。

（2）在保證終產物質量的前提下，合成時間越短越好，可以有效節約成本。

單一的合成時間（或每個堿基的合成時間）數據并不具有參考性，具備合成序列長度及終產物的質量背景是必要的，這樣合成時間的數據才有意義，才具有數據對比的可信性。

（3）合成規模范圍廣

（4）儀器功能選擇多樣且全面，靈活

（5）軟件使用滿足定制化需求，操作便捷，設計人性化

3. 含水量

寡核苷酸化學合成對水分極其敏感，環境的濕度，合成試劑/乙腈的含水量，配制單體質量的完美度，都將對合成終產量產生影響。

4. 化學修飾

通常合成化學修飾的產物具有較差的偶聯效率，使偶聯效率低至90%的情況也并不罕見。修飾若是通過與胺，硫醇或羧基官能團偶聯而制備，會受到諸多因素的影響，包括試劑的質量和新鮮度，寡核苷酸的序列和緩沖液的質量等等，即便是普通的共軛也可以對最終產品的產量產生相當大的不利影響。

不同堿基的修飾其偶聯效率無法達到100%。例如：4個常見 DNA 堿基的標準偶聯效率可達98-99.5%，而有些修飾堿基的偶聯效率可能低至50%。

5. 專業的技術人員及成熟的合成工藝

經驗豐富的技術人員及成熟的合成工藝對高效寡核苷酸的合成來說必不可少。

6. 合成后的脫保護

對于沒有復雜化學修飾的寡核苷酸，只要脫保護試劑是新鮮的，不會有太大影響。特定的修飾需要非常溫和的脫保護條件，但是堿基可能無法完全去除保護基團。在大多數情況下，堿基本身也會因脫保護反應會有一些損傷，尤其對熒光染料標記的產物會有不利影響，導致較低的產率。

7. 純化

純化是可能會損失大部分產量的步驟，即便高質量的合成只是將適量的雜質去除，也會損失一大部分產物。中等和較差質量的合成會有更多的雜質，為純化帶來更大的難度從而對產量有更加不利的影響。因此，無論合成質量如何，純化過程的整個過程都會導致較低的總得率。在多種因素的影響下，理論產量的50%左右可被消耗。

此外，寡核苷酸上的修飾會導致產物與較短的片段共洗脫，因此純度對產量會有相當大的影響，90%和95%的純度差異導致可能相差幾倍的終產量。

三、提升合成終產量的方法

雖然合成產物的損耗是必然的，但是盡可能地增加產量及減少產物的不必要損耗一直是技術創新與優化的動力和追求。對合成終產量的提升，可以從以下幾方面著手：

1. 使用高質量合成試劑：采購并使用具有質量認證的試劑、耗材等，合成實驗所用的所有試劑需確保其新鮮度。

2. 優化合成工藝：合成實驗前儀器的準確校準是十分重要且必要的。在保證合成效率的前提下，合理優化合成反應時間。合成產量與合成效率非常非常的緊密相關，越高的合成效率往往需要越長的合成時間。單純追求合成時間的縮短，必然會帶來合成效率的折損導致產量的大幅下降，反而會輕易增加更多更多成本的投入。

3. 使用性能參數優佳的合成儀：在對比各品牌儀器的性能參數時，具備一定前提和背景的數據才是有意義且值得參考的。比如，在合成較長鏈且可獲得一定的產物得率的情況下，合成效率可達99%以上；多長的某種序列，合成質量滿足于何種應用場景，合成時間越短才越有優勢。

來自 LGC Biosearch Technologies™ 的 —— MerMade™ 系列 DNA/RNA 合成儀

性能優勢：

• 合成規模50 nmol、且序列長度到80 nt，在同時滿足合成產量和合成長度的前提下，效率可高達99%以上；

• 合成標準20 mer、用于PCR的寡核苷酸，可在3小時內完成；

• 合成規模可達50-200 µmol;

• 靈活多樣的瓶位設計滿足豐富的修飾種類；

• 儀器可做定制化升級；

• Trityl monitor；

• 軟件設計業內口碑好，可滿足各種定制化需求，且操作便捷、設計人性化。

   

此外，LGC Biosearch Technologies 還提供廣泛的寡核苷酸合成試劑，包括修飾單體、CPG、合成柱等1000 多種專業產品，打造*的整體核酸化學 (NAC) 解決方案及全套產品組合，滿足用戶對相關寡核苷酸的需求。

LGC Biosearch Technologies 致力于提供一站式高品質寡核苷酸產品，其質量管理體系 (QMS) 獲得了 ISO 9001 認證。所有關鍵原材料和所有中間體直至最終產品都在其QC流程的監管范圍內。在 QC 之后，所有批次都將經過 QA 審查。

如果客戶需要其他的質量標準（例如 ISO 13485）認證，LGC Biosearch Technologies 可提供其它流程來滿足特定需求。例如：除了質量控制 (QC) 檢測和質量保證 (QA) 審查外，也可以出具檢驗報告書 (CoA)，隨產品一起寄送到客戶手中以迎合大部分客戶的質量需求。而且，還可提供與 QC 檢測結果一致的分析報告副本，和CoA隨附產品寄送給客戶，目前已為很多客戶提供過這類服務。

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Reference:

[01] Brown T, Brown T, Jr. (2005-2015) Solid-phase oligonucleotide synthesis. [Online] Southampton, UK, ATDBio. (Accessed October 6, 2015.)

[02] Hogrefe R. (2015) A Short History of Oligonucleotide Synthesis. [Online] San Diego, TriLink BioTechnologies. (Accessed October 8, 2015.)

* 本文轉載自LGC基因組學公眾號